摘要：本文开发了一种可一起测定葡萄酒中八种真菌毒素的办法，包含黄曲霉毒素 B1、B2、G1 和 G2、展青霉素、吐逆毒素、赭曲霉毒素 A 以及 玉米赤霉烯酮。在氯化钠和硫酸镁存在的条件下，选用乙腈对样品进行开始提取。选用旋转蒸腾法对得到的提取物进行浓缩，然后进行复溶，再运用超高效液相色谱 (UHPLC) 三重四极杆质谱多反响形式 (MRM)检测。结果标明在红葡萄酒和白葡萄酒中八种真菌毒素的检测限 (LOD) 别离在 0.050 至3.3 µg/L 和 0.030 至 8.0 µg/L 范围内，定量限 (LOQ) 别离介于 0.15 至 2.5 µg/L 和 0.10至 25 µg/L 范围内。关于悉数八种真菌毒素，在选定的两个数量级的基质匹配校准范围内线性呼应杰出，线性回归系数为 0.995 或更高。关于所测定的两个加标水平，回收率介于 59.6–132.4%，精密度 (RSD) 介于 1.2–21.1% (n = 6)。其间，大部分加标样品的回收率为 70%–120%，RSD 小于 10%。本文开发的办法快速、精确、活络，可用于葡萄酒中多种真菌毒素的高通量惯例筛查，并或许扩展到其它发酵酒类样品的运用中。

前语真菌毒素是由各种真菌在适合的气候条件下自我仿制而生成的一系列次级代谢产品。已见诸报导的真菌毒素有 300 余种。研讨标明一些真菌毒素会导致多种不良健康效应，包含按捺免疫体系，诱发癌症及变形，搅扰成长发育，等等 [1,2]。用于酿酒的农产品（例如葡萄）在成长、贮存和加工进程中易感染真菌，从而遭到真菌毒素的污染。赭曲霉毒素 A (OTA) 是葡萄酒中最常见的一种真菌毒素 [3-5]。欧盟 (EU) 规则酒中 OTA 的最高定量为 2 µg/L。事实上许多其它的真菌毒素也或许存在于酿制完结的酒中，例如黄曲霉毒素（B1、B2、G1 和 G2），吐逆毒素 (DON)、玉米赤霉烯酮 (ZEN)、展青霉素 (PAT) [6,7]。一些国家和国际组织现已规则了大多数原始农产品中这类真菌霉素的最高定量。可是，这些真菌毒素在酒中的定量至今并没有得到太大的重视。不同于其它食物产品，酒是一种特别的饮品，其主要成分为酒精。与真菌毒素本身对人体健康的影响比较，在喝酒的一起摄入真菌毒素或许会加剧影响。一篇近期的报导指出，小鼠一起摄入黄曲霉毒素 B1（一种致癌的真菌毒素）及乙醇表现出加合效应，会明显加剧对其肝脏的氧化损害 [8]。与其它食物比较，人体对酒中某些真菌毒素的耐受性或许较低，因而，需求树立一种活络牢靠的办法对酒中的潜在真菌毒素进行惯例筛查，以保证顾客的安全。对酒中的潜在真菌毒素进行惯例筛查以保证安全性。高效液相色谱电喷雾串联质谱法 (HPLC-ESI-MS/MS)，结合多种预提取技能，已广泛运用于检测玉米、饲料、牛奶及草药等基质中的真菌毒素 [9-14]。可是，很少有报导重视葡萄酒中的多种真菌毒素 [15]。本运用简报依据 UHPLC-ESI-MS/MS 技能，展现了一种用于快速有用检测葡萄酒中潜在八种真菌毒素的高通量检测办法。

试验部分试剂、化学品和样品八种真菌毒素包含展青毒素 (PAT)、吐逆毒素 (DON)、黄曲霉毒素G1 (AFG1)、黄曲霉毒素 G2 (AFG2)、黄曲霉毒素 B1 (AFB1)、黄曲霉毒素 B2 (AFB2)、赭曲霉毒素 (OTA) 以及玉米赤霉烯酮 (ZEN)（纯度大于等于 99%）均购自 Romer 试验室（澳地利）。甲酸和乙酸铵别离购自美国六合及赛默飞世尔科技公司。红葡萄酒和白葡萄酒均为进口葡萄酒，从当地进口商处随机挑选。真菌毒素化合物的标准溶液制备选用纯甲醇制造，储藏溶液浓度为 10 µg/mL，于 –18 °C 下贮存。运用甲醇/水（20:80，体积比）将其稀释至恰当浓度用于校对。样品前处理精确量取葡萄酒样品 2.5 mL 于离心管中,参加 20 mL 纯乙腈 (ACN)混合。然后向离心管中参加氯化钠 (2 g) 及硫酸镁 (0.25 g)。对所得混合物涡旋振动 3 min 后，在 8000 rpm 下离心 10 min。将占原始体积 80% 的上清液转移至洁净的鸡心瓶中，40 °C 下旋转蒸腾至近干。残渣用 2 mL 甲醇/水（20:80，体积比）复溶，并用0.22 µm 膜过滤后，进行 UHPLC-ESI-MS/MS 剖析。为了查验是否需求进一步净化，这儿别离尝试了 C18、PSA 和石墨化炭黑 (GCB) 对提取液进行净化。乙腈提取后所得的上清液均分为三等份参加离心管中，别离与 C18、PSA 和 GCB 混合，继续振动 10 min。将混合物在 8000 rpm 下离心 10 min，所得的上清液选用旋转蒸腾进一步浓缩。所得残渣用 2 mL 甲醇/水（20:80，体积比）复溶，并用 0.22 µm 膜过滤后，进行 UHPLC-ESI-MS/MS剖析。运用真菌毒素的回收率点评净化功率。

基质效应点评为了验证红葡萄酒或白葡萄酒基质是否会影响这些真菌毒素检测的精确度，依据样品前处理进程向葡萄酒中参加一定量的真菌毒素。选用 UHPLC-ESI-MS/MS 剖析所得到的样品。比较每种剖析物与相同水平标准溶液中真菌毒素的峰面积。与标准溶液比较，加标基质样品中峰面积份额的下降或添加别离代表基质按捺或增强的程度。基质匹配的线性校对、检测限及定量限为了点评线性及检测活络度，选用事前确认无检测方针剖析物的空白基质。同样品相同，对空白基质进行提取和浓缩。所得残渣运用一系列溶于甲醇/水（20:80，体积比）的真菌毒素标准溶液进行复溶。基质匹配的标准溶液用 0.22 µm 膜过滤后，进行UHPLC-ESI-MS/MS 剖析。对每种剖析物的峰面积及其浓度进行相关剖析以验证线性。运用基质匹配校准标样的低浓度样品生成的S/N，计算所开发办法的检出限 (S/N= 3) 及定量限 (S/N = 10)。精确度和精度为了验证办法的精确度和精密度，向空白基质中参加两个水平的各种真菌毒素作为加标样品，重复剖析六次。因为葡萄酒、葡萄或其它可参阅农产品中每种真菌毒素所规则的定量水平相差很大，且每种真菌毒素的质谱活络度相差也很大，因而将我国法规中现行最高定量水平及其四分之一水平作为每个剖析物的加标水平。加标样品前处理同样品前处理进程相同，并选用 UHPLC-ESI-MS/MS进行剖析。运用六次重复测定的均匀回收率和相对标准偏差点评办法的精确度和精密度。‘

UHPLC-MS/MS 条件整个研讨进程中均选用 Agilent 1290 Infinity UHPLC 体系。其包含 1290 Infinity 二元泵、自动进样器和柱温箱。选用 AgilentZORBAX Eclipse Plus C18 色谱柱（100 mm × 2.1 mm，1.8 µm）进行八种真菌毒素的别离。活动相是溶液 A 和溶液 B 的在线混合物，其间 A 为纯水，B 为含有 5 mmol/L 乙酸铵的甲醇。初始梯度为 10% B，0–2.4 min 内线性添加至 42% B，然后在 2.4–6 min内继续添加至 51% B。接着在 6.0–6.2 min 内，% B 快速添加至90%，坚持 2 min 以保证一切剖析物和搅扰物质可从色谱柱中洗脱出来。流速为 0.4 mL/min，进样量为 5 µL，柱温为 40 °C。两次接连剖析间的柱平衡时刻设置为 1 min。UHPLC 体系的洗脱液由射流电喷雾 (JetStream ESI) 离子源直接进入 Agilent 6460 三重四极杆 MS/MS 体系，并在多反响监测形式 (MRM) 下进行检测。正 (pos) 和负 (neg) 形式下的一般离子源参数如下：毛细管电压，3500 V (pos)，2000 V (neg)；喷嘴电压，500 V (pos)，1900 V (neg)；枯燥气温度，325 °C；枯燥气流速，6 L/min；雾化气压力，45 psi；鞘气温度，350 °C；鞘气流速，11 L/min。针对每种化合物优化毛细管出口电压和磕碰能量。

结果与评论离子形式的挑选及多反响监测参数的优化在所研讨的八种真菌毒素（图 1）中，PAT、DON、OTA 和 ZEN含有羟基、酚羟基或羰基配体，较易在 ESI 进程中丢掉质子，因而需求在负离子形式下进行剖析以获取高活络度。相反，黄曲霉毒素含有羰基和甲氧基配体，较易在 ESI 进程中取得质子，因而在正离子形式下剖析能够获取较高的活络度。在所挑选的离子形式下，运用 6460 三重四极杆 MS/MS 体系别离剖析溶于 20% 甲醇水溶液的各种真菌毒素。选用人工或优化软件优化每个 MRM 离子对的毛细管出口电压 (fragmentaor voltage)和磕碰能量 (collision enegy)。毛细管出口电压由 70 V 扫描至200 V，挑选最高质谱呼应时的电压作为优化值，并用于进一步的磕碰能量挑选。然后运用一系列磕碰能量（CE 由 5 V 至 50 V）裂解剖析物。挑选可取得最高强度和第二高强度碎片的磕碰能量别离作为定量和定性 MRM 离子对的优化磕碰能量。优化后的参数列于表 1。

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