运用序列特异性的CAS内切酶进行精确性敲除，敲入，替换等已成为一种常用的分子生物学手法。可是，为了辨认所需的基因修饰，扫除脱靶克隆，依然需求挑选几百个单克隆细胞系。而很多克隆的保护和挑选是一个吃力、耗时、简单犯错的进程。

欧洲分子生物学试验室（EMBL）研究人员Moritz Kueblbeck, Andrea Callegari等共享了一种快速验证基因修改作用的试验计划。该计划运用naica^®微滴芯片数字PCR体系（Crystal Digital PCR™）完结了一次三色剖析就可完结方针复制数的评价和脱靶事情的检测。且根据数字PCR (dPCR)的高敏感性，无需很多的样品，因而，在前期就能够完结挑选试验。Crystal Digital PCR™一次试验3个小时内就可完结，关于修改过错的克隆当天就可停止培育。那么这个试验详细是怎样规划的？就让咱们一同来看看吧。

运用亮点：

▶ naica^®微滴芯片数字PCR体系一次三色剖析一起完结方针复制数的评价和脱靶事情的检测，是十分强壮的juedui定量东西。

▶ naica^®微滴芯片数字PCR体系对长刺进片段(如mEGFP)复制数供给稳健的检测办法。

▶ naica^®微滴芯片数字PCR体系只需少数生物样本，能够在前期完结检测，快速完结CRISPR挑选，节省时间。

Single-step 3-color Crystal Digital PCR™试验规划：

该试验共规划了三个探针：

1.“total tag”（HEX基团符号）检测mEGFP转基因；

2.“on-target tag”（FAM基团符号）检测内源NUP93修改位点的zuihou一个外显子与整合的mEGFP转基因(标签)的5'序列之间的衔接；

3.reference(CY5基团符号)作为内参，对“total tag”和“on-target tag”进行归一化。“total tag”归一化取得整合的mEGFP复制数和“on-target tag”取得靶标上整合的mEGFP复制数。

试验运用U-2 OS细胞作为基因修改目标，其具有3个NUP93等位基因。

成果剖析：

如图B所示，对多个U-2 OS细胞系的基因修改作用进行剖析，naica^®微滴芯片式数字PCR体系成果显现克隆35，52和247的U-2 OS细胞mEGFP总复制数和靶标复制数都为3，这表明这三个细胞系的一切3个NUP93等位基因都成功修改，没有脱靶，这个成果与检测金规范的Southern blot的成果共同（图C），而克隆5尽管mEGFP总复制数和靶标复制数共同，但与NUP93位点的预期数量不匹配。这表明其或许发生基因组的重排，而Southern blot成果也验证了这一现象，其呈现了一个小于正常NUP93的复制条带。关于克隆25和246，尽管其靶标复制数契合预期，可是其总复制数大于3，这表明其或许存在脱靶整合或许不完全HDR（homology-directed repair）现象，而Southern blot成果显现其存在一个过大的整合条带，表明其或许存在基因重排。

上述这些成果表明根据naica^®微滴芯片式数字PCR体系（3-color Crystal Digital PCR™）的基因修改脱靶检测的三色数字PCR检测办法，是一种快速简洁的一步检测办法，其成果与耗时更长的Southern blot技能完全共同，能够用来快速评价基因修改作用，挑选合适的基因修改细胞株系。