流式细胞技能（flow cytometry，FCM）是使用流式细胞仪进行的一种单细胞定量剖析和分选技能。流式细胞术是单克隆抗体及免疫细胞化学技能、激光和电子计算机科学等高度开展及综合使用的高技能产品。

一、根本结构
流式细胞仪由三部分构成
1.液流系统，包括活动室和液流驱动系统;
2.光学系统，包括激发光源和光束搜集系统;
3.电子系统，包括光电转换器和数据处理系统。流式细胞仪的I作原理是使悬浮在液体中涣散的经荧光符号的细胞或微粒逐一经过样品池，一起由荧光探测器捕获荧光信号并转换成别离代表前向散射角、侧向散射角和不同荧光强度的电脉冲信号，经计算机处理构成相应的点图，直方图和加三维结构图画进行剖析。用于FCM的样本是单细胞悬液，可所以血液、悬浮细胞培育液、各种体液、新鲜实体瘤的单细胞悬液以及白腊包埋安排的单细胞悬液等。

二、流式细胞术的根本操作与技巧
1）细胞的制备、培育
2）关闭
3）荧光素偶联抗体符号
4）光电倍增管电压的设定
5）对照的设置
6）补偿调理

以体外培育的PBMC细胞为例：
1、细胞培育在96孔板中，直接搜集细胞于1.5ml的EP管中，350g，4°C离心5min，弃上清；
2、然后用1ml FACS buffer重悬沉积，350g，4°C离心5min，弃上清；
3、关闭：符号样品细胞的荧光素偶联抗体多为单克隆抗体，少量也或许是多克隆抗体，其根本结构都由两部分组成，即包括有特异性结合抗原位点的Fab段和相对保存的Fc段，抗体的特异性表现在Fab段，符号时使用Fab段的抗原结合位点与细胞上抗原分子特异性结合，然后符号而且相对量化细胞表达该抗原分子的状况。可是，有些细胞外表表达FcR(Fc receptor, Fc受体），如巨噬细胞、DC、B淋巴细胞等， FcR能够与荧光素偶联抗体的Fc段进行非特异性的结合，对成果产生必定的影响。

关闭办法1： 取适量的血清全IgG抗体与样品细胞充沛混匀，4'C静置 15min。研讨人的细胞时，若荧光素偶联抗体来历于小鼠，关闭选用小鼠血清全IgG抗体。准则是，假设流式抗体或许与样品细胞的FcR产生非特异性结合，那么在符号荧光素偶联抗体之前先用流式抗体同源的全IgG抗体进行关闭，使样品细胞外表的FcR饱满。

关闭办法2： 适量的抗CD16和抗CD32单克隆抗体与样品细胞充沛混匀，4'C静置 15min。CD16是一种FcR, 能够与IgG的Fc段结合，亲和力较强；CD32也是一种 FcR, 能够与IgG的Fc段结合，亲和力中等。而荧光素偶联抗体根本上是IgG抗体，所以在符号荧光素偶联抗体前能够用抗CD16和抗CD32单克隆抗体关闭样品细胞，使样品细胞外表的FcR都被抗CD16 或抗CD32单克隆抗体结合，然后阻挠后续荧光素偶联抗体与FcR的非特异性结合。

4、符号相应的荧光素偶联抗体，这儿以CD3-APC-Cy7、CD4-FITC为例，一般染色系统引荐100μl，CD3、CD4表达量相对较高，1μl足够了，假设有9个样本，别离取10μlCD3-APC-cy7、CD4-FITC加到含有990μl的1.5ml的EP管中，混匀后，别离取100μl加到9个样品孔中，混匀，室温、避光染色20min；

5、加1ml FACS buffer洗去未结合的抗体，350g，4°C离心5min，弃上清，用200μl FACS buffer或2%的多聚甲醛重悬沉积，赶快上机剖析。

6、电压的设定：上机剖析时，承认机器没有问题后，首要便是调理每个通道的光电倍增管的电压，意图是为了区别细胞群，假设咱们想研讨人的淋巴细胞群，咱们都知道人的PBMC含有淋巴细胞、单核细胞还有中性粒细胞等，那咱们怎样把它们分隔呢？这时分就要用到咱们前面提过的FSC和SSC，经过调理FSC和SSC的电压，区别淋巴细胞亚群，准则便是使样品细胞或许方针细胞坐落流式图的中心或许接近中心的方位。FSC和SSC的电压确认之后就开端调理APC-cy7、FITC的电压（咱们能够在铺细胞的时分多铺一个孔，染色时将CD3-APC-cy7、CD4-FITC均染上，用于FSC、SSC、APC-cy7、FITC电压的调理），准则便是使阳性细胞群和阴性细胞群尽或许的别离。

三、注意事项

（1）在细胞制备、培育阶段，假设该培育细胞是贴壁细胞，需用先用胰酶消化细胞，然后搜集待测样品细胞，离心、洗刷、关闭后符号荧光素偶联抗体即可。

（2）假设是胸腺、脾脏和淋巴结等外周免疫器官，主要由免疫细胞组成，制成单细胞悬液，只需直接将脏器经钢网研磨即可。

（3）假设是实体脏器肺脏、肝脏和肿瘤安排内含有较多的结缔安排，实体脏器细胞之间一般结合严密，所以直接研磨脏器法无法得到抱负的单细胞悬液。因而，研磨前需将脏器剪碎后参加IV型胶原酶和DNA核酸内切酶消化，消化后的安排再用研磨棒直接研磨。实体脏器研磨后的单细胞悬液以实体细胞为主，假设研讨方针不是实体细胞，而是脏器内滋润的免疫细胞，能够用Percoll密度梯度离心法富集免疫细胞，然后再进行流式剖析。

（4）调理电压时，假设检测的方针细胞体积较小，能够恰当进步电压值，使方针细胞与细胞碎片在流式图中能够彻底别离；假设检测的方针细胞体积较大，能够恰当下降电压值，使一切的方针细胞群完好显现于流式图中，避免细胞群接近于流式图的鸿沟而变形歪曲或许彻底处于鸿沟外。

（5）关于样本的关闭，并不是符号荧光素偶联抗体之前有必要关闭样品，一般样品细胞与流式抗体的种属来历是不同的，如符号人的细胞的荧光素偶联抗体一般来历于小鼠，人细胞的FcR也不必定能够与小鼠来历的荧光素偶联抗体的Fc段结合，可是，也有或许由于种属联络较近，或许在必定环境条件下这种不同种属间的Fc段和FcR也能结合，试验者很难判别试验过程中这种结合是否会产生，可是在符号荧光素偶联抗体前关闭样品却能够确保这种非特异性结合必定不会产生。所以，条件答应的话，试验者最好养成关闭样品的习气。