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一、总RNA的提取(Trizol法提取)
在收集到生物资料之后,最好能立刻进行RNA制备作业。若需暂时贮存,则应以液氮将生物资料急速冷冻后,贮存于-80℃冷冻柜。在制备RNA时,将贮存于冷冻柜的资料取出,当即以参加液氮研磨的方法打破细胞,不可以先行冻结,以防止RNase的效果。
1. 提取安排RNA时,每50~100mg安排用1ml Trizol试剂对安排进行裂解;提取细胞RNA时,先离心沉积细胞,每5-10 ╳106个细胞加1ml Trizol后,反复用枪吹打或剧烈振动以裂解细胞;
2. 将上述安排或细胞的Trizol裂解液转入EP管中,在室温15~30C下放置5分钟;
3. 在上述EP管中,依照每1ml TRIZOL加0.2ml氯仿的量参加氯仿,盖上EP管盖子,在手中用力震动15秒,在室温下(15℃~30℃)放置2~3分钟后,12000g(2℃~8℃)离心15分钟;
4. 取上层水相置于新EP管中,依照每1ml TRIZOL加0.5ml异丙醇的量参加异丙醇,在室温下(15℃~30℃)放置10分钟,12000g(2℃~8℃)离心10分钟;
5. 弃上清,依照每1ml TRIZOL加1ml 75%乙醇进行洗刷,涡旋混合,7500g(2℃~8℃)离心5分钟,弃上清;
6. 让沉积的RNA在室温下天然枯燥;
7. 用Rnase-free water 溶解RNA沉积。
二、琼脂糖核酸电泳
1. 用蒸馏水将制胶模具和梳子冲刷洁净,放在制胶平板上,关闭模具边际,架好梳子;
2. 依据欲别离DNA 片段巨细用凝胶缓冲液制造适合浓度的琼脂糖凝胶:精确称量琼脂糖干粉,参加到配胶用的三角烧瓶内,定量参加电泳缓冲液(一般20~30 ml);
3. 放入到微波炉内加热熔化。冷却顷刻,参加一滴荧光染料,悄悄旋转以充沛混匀凝胶溶液,倒入电泳槽中,待其凝聚;
4. 室温下30~45分钟后凝胶彻底凝聚,当心拔出梳子,将凝胶安放在电泳槽内;
5. 向电泳槽中倒入电泳缓冲液,其量以没过胶面1mm为宜,如样品孔内有气泡,应设法除掉;
6. 在DNA样品中参加10×体积的载样缓冲液(loading buffer),混匀后,用枪将样品混合液缓慢参加被浸没的凝胶加样孔内;
7. 接通电源,赤色为正极,黑色为负极,牢记DNA样品由负极往正极泳动 (接近加样孔的一端为负)。一般60~100V电压,电泳20~40min即可;
8. 依据指示剂泳动的方位,判别是否停止电泳;
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